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Technologies d'analyse de génie génétique (7)

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lisgr's version from 2016-06-26 08:49

Détecter les acides nucléiques

Question Answer
Agent intercalant - rôledétecter ET quantifier la présence ADN ou ARN -> par absorbance
Comment détecter AN par UVmet un acide nucléique dans une cuvette, fait passer UV (260nm) à travers la cuvette, mesure de la lumière absorbée. -> intensité a diminué
Absorption / concentrationabsorption et protportionnel à la concentration ADN / ARN
Détecter ADN par un agent intercalantagent intercalant lie l'ADN pour former un complexe fluo. Met dans une cuve -> la lumière vers la cuve -> stimule agent intercalant qui émet une lumière fluo dans toutes les directions -> détecté à 90° -> quantifié
agent intercalant + ADN renvoie lumière - caractéristiquesNRJ plus faible, donc lambda plus grand
Agent intercalant structureplan, aromatique cyclique. Très bonne affinité ADN.
Agent intercalant - défauts'intercale entre 2 bases, donc modifie hélicité de l'ADN. -> impact réplication, et mutagène
Exemple agent intercalantSYBR green, bromure d'éthidium
Agent intercalant - traitementcontre cancer, car empêchent la réplication, donc peuvent bloquer la fivision cellulaire -> mais pas spécifique, donc bloque la transcription de toutes les cellules
Exemple de médoc intercalantsdoxorubicine, anthracyclines -> agissent sur les topoisomérases
Électrophorèse ADNMet ADN dans un gel, + des électrodes, elles sont nég, donc migrent vers le pole +
Electrophorèse ADN - gelpolyacrylamide ou agarose, on met l'ADN dans les puits du gel
Electrophorèse ADN - discriminationles plus légères migrent plus loin (fonction taille)
Electrophorèse ADN - gros machin truc2 cuves de liquide avec solution ionique, et un contact entre les 2 cuves pour transmettre le courant. Le gel est entre les 2 cuves, et l'ADN migre vers +
Une fois électrophorèse terminée - visualisation des protéinesajoute dans le gel du bromure d'éthidium + expo UV -> visualisation
Sensibilité Electrophorèse + bromureqqs ng ADN
Electrophorèse capillaire gelgel de polyacrylamide + courant électrique
Electrophorèse capillaire principecourant, les molécules -> +, détecteur qui détecte ce qui sort au moment ou il sort -> petites avant
Bioanalyseraprès electrophorèse capillaire, analyse des fragments -> fluorescence en fonction du temps
Hybridation des AN - attentiondoit être parfaitement complémentaire
Hybridation - comment marche1) la séquence complémentaire à la séquence recherchée (potentielle) est immobilisée sur un support solide 2) un échantillon AN -> LES NT MARQUÉS AU PHOSPHORE mis en contact avec la séquence 3) élimine par lavage autres -> émission radiactive permet voir et quantifier
Western blotprotéines
Southern blotADN
Northern blotARN
Southern / nother blot - principe1) gell électrophorèse 2) met ce gel sur un papier buvard dont les bords trempent dans le NAOH, ce qui permet par CAPILLARITÉ de séparer les brins du gel -> feuille de nitrocellulose. -> après le nitrocellulose, buvards secs pour le liquide, mais la séquence reste sur le nitrocellulose
La feuille de nitrocelluloseplacé dans un sachet avec la potentielle séquence complémentaire, marquée -> exposition voit la séquence marquée
Microarrayssouthern blot qui sont mignaturisés. Des cases avec différentes séquences Adn fixées à un support = 1 case = 1 meme séquence en plusieurs fois 2) puis met ADN se fixent aux cases
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Fabriquer de l'ADN

Question Answer
Méthode chimique ) caractéristiques1) ADN modifiés 2) forme monocaténaire 3) longueur inférieure 200 nucléotides
Méthode chimique - explication étape 11) support solide avec fixé un ribose en C3' + sa base= AVEC UN GROUPE R3 + pas de Phosphate = nucléoside 2) on ajoute un nucléotide avec une base GROUPE R3 + 1 seul phosphate modifié avec un groupe sortant + R2 en 3' ATTENTION et en 5' pas de phosphate mais un o + R1
Les molécules qui ont des groupes protecteurs1) le 0 en 5' 2) R2, le Phosphate modifié en 3' 3) la base
Méthode chimique - cycle 1une première liaison dans le sens 3' -> 5' entre le phosphate de C3' et le O de 5'-> expulsion groupe sortant, et donc oxydation du Phosphate
A la fin de chaque cycle déprotectionque de O en C5'
Déptrotection méthode chimiquela déprotection de tous les autres a la find e tous les cycles
Fin de la méthode chimiquehydrolyse pour libérer 3'
Sens de la synthèse chimique3' -> 5'
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Méthode enzymatique: pas de synthèses non existantes, que des copies

Question Answer
Enzyme utiliséeADN pol bactérienne, humaine trop compliquée, pas d'hélicase: méthode chaleur, pas d'ARN primase: oligonucléotide chimique
Méthode enzymatique - fonctionnelemnt1) chaleur pour dénaturer, 2) on ajoute un oligonucléotide ARN fabriqué par procédé chimique = amorce ARN 3) ajoute les substrats et l'adn polymériyse
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Méthode de Sanger: séquencage

Question Answer
Enzymes utilsées1) ADN polymérase pas hélicase: chauffe, pas de primase (méthode chimique)
Substrats utilisésDNTP + DDNTP
Méthodechauffe, puis place une amorce, synthèse commence. Ajoute soit ddntp soit dntp> ddntp marqués par fluo/ radio marque la fin
Analyse des fragments sangersépare par électrophorèse capillaire, puis analyse la couleur des brins sachant que les derniers brins colorés = 3' -> donne séquence 3' -> 5' COMPLÉMENTAIRE
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La PCR

Question Answer
Cycle 1la molécule entière dénaturée à 95°c 2) on abaisse la température pour la fixation des amorces -> EXTRÉMITÉS DE LA SÉQUENCE INTERET 3) ADN pol + dntp à T 70°
Chaque cycle molécule ADN2^nombre de cycles -> processus exponentiel
Nombre de cycle augmente quelle séquence augmentecelle délimitée des deux cotés par les amorces: la séquence interet
Le poids d'une PCR2(pb) x 300 (dalt pour 1 nucl) x nb pb / 6x10^23
Choix de l'enzymesouvent taq: thermophile fonctionne a plus de 70°c
Inconvénient de TAQbeaucoup erreurs
Température de fixation de l'amorceTm car 50% des amorces sont hybridées
PCR rôledétecte la séquence mais aussi la quantifie surtout PCR en temps réel
PCR en temps réelusage de SYBR green permet de suivre en temps réel
Seuil de visibiliténombre de cycles a partir duquel on voit la fluoresceence
Exercice1) calcule de la soustraction= nombre de cycles 2) calcul du nombre de molécules: 2^nombre de cycles 3) multiplie par le nombre dans l'autre échantillon
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Transcription inverse

Question Answer
Rôlepallier à la PCR transformer de l'ARN en ADN
EnzymesADN polymérase ARN dépendante: transcriptase inverse, pas ARN pol car amorce est chimique, pas dhélicase car ARN simple brin
FonctionnementOn fixe une amorce ADN à 3': poly T, transcriptase inverse transcrit 5'->3' = ADNc
ADNc qu'en fait onchauffe, dénature ARN, reste ADNc monocaténaire, et souvent PCR pour amplifier
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PCR si on veut plutot savoir si une séquence de virus est la: PCR + electrophorèse ..., si on veut plutot savoir si une séquence a mutation PCR + séquencage

La méthode biologique, les plasmides

Les enzymes

Question Answer
Nucléasesdécoupent en présence de H20 la liaison phosphate en 3' ou en 5'
Exonucléasesenzymes qui dégradent une seule des extrémités -> 5' 3', dégrade 5', ou 3'-> 5' dégrade 3'
endonucléasess'occupent de l'ADN au milieu de la molécule lyse les deux brins à la fois
Enzymes de restrictionsont des endonucléases, coupent des séquences très particulières
EcoR1coupe en laissant extrémité 5' en extension toujours
Enzymes de restrictions séquences reconnuespalyndromiques de 4 àà 8 nucléotides
Enzylmes de restrictions chez quiprocaryotes
Enzymes de restrictions rolereconnaissance ADN étranger
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