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Microbiologie 2

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anahitako's version from 2017-01-22 15:43

Importation et Exportation/Sécrétion

Membrane externe des Gram-

Question Answer
Porines - structureassemblage de protéines en trimères, forme des pores hydrophiles dans la membrane.
Porines - rôlepermet la diffusion passive de molécules hydrophiles de petite taille (< 600 kDa)
OmpAporine la plus abondante d'E.Coli
Régulation des porines OmpC/F par la pression osmotique - expliquerLorsque [NaCl] ~ 1 % -> OmpC remplace OmpF (protection car fermeture des pores + grands)
OmpC/FPorines d'E.coli, étroite (C) et large (F) régulées selon la pression osmotique.
PhoEPorine apparentée à Omp, laissant passer les phosphates.
LamBPorine laissant passer le maltose ou la maltodextrine, mais également le récepteur pour le bactériophage lambda.
Sidérophore (FepA par exemple)Protéine sécrétée par la bactérie, ayant une très haute affinité pour le fer. Se lie aux ions Fe3+ puis sont récupérés via les récepteurs sidérophores de la membrane.
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Membrane interne ou plasmique

Question Answer
PerméaseProtéine d'importation spécifique à un substrat particulier. Peut être couplé au gradient de proton ou à l'ATP ou à l'ajout d'un phosphate.
Perméase - donner un exemple de transport couplé à la force proton motriceLac Y pour l'importation de lactose.
Protéines ABC (ATP binding cassette) - structureComplexe de 3 ou 4 protéines:
- une lie le substrat dans le périplasme
- une ou 2 traversent la membrane interne
- une st située à la face cytoplasmique et hydrolyse l'ATP
Rôles des ABC (3)1) Importation de substances
2) Sécrétion de protéines par les bactéries
3) Expulsion de certains AB
Exportation =franchissement de la membrane cytoplasmique par des substances synthétisées dans le cytoplasme de la bactérie
Sécrétion =Exportation de molécules vers le milieu extérieur (molécules pas forcément synthétisées dans le cytoplasme de la bactérie)
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Mécanismes d'exportation et de sécrétion

Voie classique SEC-dépendante (passage membrane plasmique)

Question Answer
Chez les Gram+, cette voie équivaut àla sécrétion
Chez les Gram-, cette voie équivautà l'exportation de protéines vers le périplasme ou à l'insertion d'une protéine dans la membrane externe
Séquence signal - 4 caractéristiques- elle est N-terminale et comporte 20-30 aa
- son extrémité N-term est chargée +
- comprend un domaine central hydrophobe
- un site de clivage
Mécanisme - 4 étapes1) reconnaissance de la SS N-term par SecB lorsque la protéine à exporter débute sa traduction
2) SecB conduit la protéine naissante avec le ribosome et l'ARNm vers un complexe de translocation, dans la membrane interne
3) La peptidase du signal LepB, située à la face extérieure de la MP, clive la SS lors du passage de la protéine dans le complexe de translocation
4) Protéine libérée dans le milieu extérieur si Gram+. Si c'est Gram-: la protéine est libérée dans le périplasme ou insérée dans la membrane externe.
SecB - 2 rôles1) Reconnaît la séquence signal de la protéine en cours de formation.
2) Protéine chaperonne qui empêche le repliement de la protéine naissante, en la maintenant dans une conformation adéquate pour sa translocation à travers la membrane.
SecA - rôleATPase fournissant l'énergie pour la translocation de la protéine.
LepB - rôleProtéase clivant la séquence signal de la protéine, à la face externe de la membrane interne.
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Sécrétion chez les Gram -

Question Answer
type I - citer les 3 caractéristiques de l'exportation de l'hémolysine d'E.Coli ?1) Hémolysine (protéine) munie d'une SS C-terminale non clivée
2) Reconnaissance de la SS par une machinerie de transport
3) Sécrétion se déroule en une étape, sans passer par le périplasme. Ne dépend pas de la voie Sec.
type I - citer les différents intervenants et leurs rôles respectifs.Machinerie de transport = Hly B, Hly D et Tol C.
- Hly B = ATPase de la famille ABC qui fournit l'énergie au système
- Hly D = canal de sécrétion
- Tol C = protéine de la membrane externe formant la partie externe de ce canal
type II - citer les 3 caractéristiques de ce transport1) Sécrétion qui a lieu en 2 étapes, faisant intervenir une protéine fixatrice d'ATP.
2) La 1ère étape = franchissement de la membrane interne et arrivée dans le périplasme, par la voie Sec-dépendante
3) La 2ème étape = franchissement de la membrane externe par sécrétion de type II.
II - citer 3 exemples de ce genre de sécrétion.1) sécrétion de pullulanase (dégradation de l'amidon) par Klebsiella
2) sécrétion d'une endotoxine par le vibrion du choléra
3) sécrétion d'une élastase par pseudomonas
III - citer les 3 caractéristiques de ce transport.1) Séquence signal N-terminale non clivée.
2) Sécrétion activée lorsque la bactérie se retrouve au contact d'une cellule eucaryote, dans une vésicule de phagocytose d'un macrophage (sécrétion de contact).
3) Protéine sécrétée par la bactérie est directement injectée à travers la membrane eucaryote par un appendice bactérien en forme d'aiguille à seringue.
III - citer un exemple de ce genre de sécrétion.Yersinia injecte des protéines Yops dans le cytoplasme d'une cellule eucaryote, où elles jouent le rôle de toxines (bactéries échappent à la phagocytose).
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Information génétique partie 1

Réplication du génome

Question Answer
Taille du génome d'E.Coli~5 000 000 pb
Nb de gènes d'E.Coli~5000 gènes.
Plasmide =molécules d'ADN circulaires double-brin capables de se répliquer indépendamment du chromosome
Episome =molécule d'ADN, comme le plasmide, capable de se répliquer indépendamment du chromosome
Hélicases =enzymes séparant les deux brins d'ADN lors de la réplication
Primase =enzyme responsable de la synthèse d'amorces d'ARN, nécessaires à l'activité de l'ADN polymérase
Complexe enzymatique comporteprimase, ADN poly III, ADN poly I, ADN ligase.
ADN polymérase III =enzyme synthétisant le brin d'ADN complémentaire, à partir de l'amorce d'ARN
ADN polymérase I =enzyme éliminant les amorces d'ARN par son activité exo-5', afin de les remplacer par de l'ADN.
Fragments d'Okazaki =petits fragments d'ADN synthétisés entre deux amorces sur le brin, ne permettant pas une élongation continue l'ADN polymérase III
ADN ligase =enzyme reliant entre eux les morceaux d'ADN synthétisés, par des liens covalents.
Topoisomérases I et ADN gyrase =enzymes permettant de maintenir la topologie de l'ADN localement, en introduisant ou en éliminant des supers-tours d'hélice.
Réplication du génome - mécanisme1) Hélicase sépare les 2 brins d'ADN au niveau de l'oriR
2) Un complexe de réplication se lie à chaque brin et avance dans chaque direction (bidirectionnel) à partir de l"oriR = réplication en thêta
3) Les topoisomérases libèrent les tensions introduites dans la double hélice d'ADN par l'avancée de la fourche de réplication
ADN gyrase - rôle de ses sous-unités ?- GyrA (2) clive les deux brins de l'AN, se lie temporairement à l'un d'entre eux et fait tourner l'autre autour du 1er, avant de les sceller à nouveau
- GyrB (2) confère de l'énergie à GyrA par son activité ATPase
Temps de duplication =temps qui sépare deux évènements d'initiation de la réplication à oriR.
Vitesse des complexes de réplication1000 nucléotides / seconde.
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Réplication des plasmides

Question Answer
Taillede 20 à 200 kilo bases
Nombre de copiesDe 1 à plusieurs centaines de copies par bactérie
Réplication - 2 modes1) les + grands plasmides se répliquent de façon bi-directionnelle (en thêta) comme le chromosome
2) mécanisme des "cercles roulants"
Mécanisme des "cercles roulants" - 3 étapes1) Un des brins du plasmide est ouvert par une endonucléase
2) l'ADN est progressivement déroulé et les brins complémentaires au brin clivé et au brin circulaire sont formés au fur et à mesure que la molécule se déroule
3) Formation d'un concatémère ensuite débité en monomères par une endonucléase spécifique
Concatémère =polymère contenant une série de copies en tandem de l'ADN plasmidique
Plasmides incompatibles =se dit de deux plasmides ayant des systèmes de réplication ou de partition identiques, et qui ne peuvent coexister au sein d'une même bactérie, étant donné les interférences qui risquent de survenir dans le contrôle du nombre de copies de plasmides ou au moment de la séparation des deux bactéries-filles.
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Expression des gènes bactériens

Question Answer
Gène =région du génome déterminant la synthèse d'un ARN, comportant le promoteur et le terminateur, et la région codante traduite sous forme de protéine.
ARN polymérase - structure- sous-unités: 2 s.u alpha, une beta, une beta et une sigma.
- sous-unité sigma = permet reconnaissance de la boîte de Pribnow
Transcription - 4 caractéristiques1) assurée par l'ARN polymérase
2) promoteurs = boîte -35 et boîte -10 (Pribnow)
3) initiation démarre au niveau d'une purine A ou G
4) terminateur = séquence formant une structure en tige-boucle, suivie d'une série de T (entraîne le décrochage de la polymérase et l'arrêt de la transcription)
Traduction - 4 caractéristiques1) ARNm ne contiennent pas de coiffe en 5' et peut coder plusieurs protéines (polycistronique)
2) Séquence Shine-Dalgarno en -5 du codon AUG (= initiation de la traduction) reconnue par l'ARNr complémentaire (16S) de la sous-unité 30S du ribosome. Peut être présente plusieurs fois car polycistronique
3) Traduction concomitante à la transcription (pas de compartimentation cellulaire)
4) ARNms dégradés très rapidement après leur synthèse.
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Régulation de la transcription

Question Answer
Induction =lorsque la présence du substrat induit l'expression des enzymes de la voie métabolique correspondante
Répression =lorsque la présence d'un produit donné, en quantité suffisante, bloque l'expression des enzymes de la voie métabolique correspondante
Gènes co-régulés =gènes codant pour les enzymes d'une même voie métabolique, et soumis à une régulation transcriptionnelle coordonnée,
Opéron =lorsque les gènes co-régulés sont rassemblés sur une unité de transcription.
Régulon =lorsque les gènes co-régulés sont dispersés dans le génome.
Utilisation de facteurs sigma alternatifs - expliquer mécanismeUne bactérie peut exprimer un facteur sigma différent du facteur sigma végétatif (en plus de toujours exprimer ce dernier), car le nouveau facteur sigma peut induire l'expression de gènes en +, grâce à ses promoteurs très différents. C'est le cas de situations où la bactérie nécessite l'intervention de protéines particulières.
Sporulation =processus qui fait intervenir:
1) la division du génome de la bactérie
2) une septation asymétrique
3) l'empaquetage du génome dans le compartiment de la future spore
4) la lyse de la bactérie
Régulon SOS =ensemble de 17 gènes distribués sur le chromosome et contrôlés par un répresseur commun, LexA, dont le gène (lexA) fait aussi partie du régulon (il est donc auto-régulé).
Rôle du régulon SOSréparation de l'ADN suite à des lésions.
Régulon SOS - quels sont les 3 rôles de RecA ?1) Reconnaissance du dommage causé à l'ADN
2) Fixation sur l'ADN monocaténaire, qui apparaît au cours de la réplication de régions d'ADN endommagées: active la protéolyse de l'ADN endommagé
3) Clivage de LexA et le répresseur du phage lambda: on lève la répression du régulon SOS = expression des gènes de réparation de l'ADN
Quorum sensing =mécanisme de dialogue entre les bactéries: les bactéries d'une population perçoivent leur densité par la présence d'une molécule signal qui diffuse librement d'une bactérie à l'autre, à travers les membranes, et dont la concentration est proportionnelle au nombre de bactéries. Lorsque la concentration est suffisante, les bactéries d'une population réagissent en activant une série de gènes (bioluminescence / virulence / biofilms).
Gènes régulés par le quorum sensing ?gènes de virulence, gènes de bioluminescence ou encore des gènes responsables de la formation de biofilms.
AHL =molécule d'acylhomoserine lactone, qui agit comme molécule signal dans le quorum sensing de plusieurs bactéries Gram-.
Rôle du facteur sigma végétatif de l'ARN polymérase ?permet la reconnaissance des promoteurs de transcription -10 (pribnow) et -35 (boîte TATA) par l'ARN poly.
Exemples de l'usage de facteurs sigma différents1) sporulation chez les Bacillus
2) apparition de flagelles dans un milieu aqueux
3) adaptation aux T° élevées
4) adaptation à un environnement riche en nitrate
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Régulation post-transcriptionnelle par les petits ARNs

Question Answer
Inhibition de la traduction - expliquer mécanismepetits ARNs se fixent au début des ARNm par complémentarité, et masquent la séquence Shine-Dalgarno ou le codon AUG initiateur: empêchent ainsi la liaison du ribosome et la traduction de l'ARNm.
Activation de la traduction - expliquer mécanismepetits ARNs s'apparient par complémentarité à un ARNm, modifient sa conformation et rendent l'AUG initiateur plus accessible au ribosome.
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Mutations

Question Answer
Activité exonucléase 3'-5'activité de relecture de l'ADN néo-synthétisé.
TransitionÉchange de deux nucléotides de type purine (A<->G) ou pyrimidine (C<->T).
Transversion - def + csqRemplacement d'une purine par une pyrimidine ou vice-versa --> non-sens
Délétion - définition + csqPerte d'un nucléotide -> Faux sens
Insertion - définition + csqUn nucléotide supplémentaire -> changement du cadre ouvert de lecture ORF
DélétionPerte d'un nucléotide.
TranslocationDéplacement de régions d'ADN.
Mutation ponctuellemutation n'affectant qu'un seul nucléotide.
Mutation silencieusePas d'effet sur la traduction.
Mutation non-sensIntroduction d'un codon STOP au milieu d'une région codante -> synthèse d'une protéine tronquée.
Mutation faux-sensChangement de l'AA introduit dans la protéine.
Mutation frame-shiftDécalage du cadre de lecture -> synthèse d'une protéine totalement différente
Criblage =technique d'isolement de bactéries auxotrophes, où on teste la capacité de la bactérie à se multiplier sur un milieu contenant l'aa voulu VS un milieu qui ne le contient pas.
Technique des répliques (3 étapes) =1) ensemançage des bactéries sur un milieu complet solide contenant l'aa, où chaque bactérie donne une colonie
2) application d'un velours sur la culture, puis sur une deuxième boîte de Pétri (cachet) dépourvu de l'aa en question
3) on identifie les bactéries auxotrophes, car elles poussent sur la 1ère boîte mais pas sur la 2ème boîte
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