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Methodo mutagenese

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elodiepayet's version from 2018-03-05 15:32

Section 1

Question Answer
AA hydrophobeAlanine, Valine, Isolecine, Leucine, Méthionine, Phénylalanine, Tyrosine, Tryptophane
AA hydrophyleLysine, Arginine, Histidine, Aspartate, Glutamate, Sérine, Asparagine, Thréonine, Glutamine
Spécial AACystérine, Glycine, Proline
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Section 2

Question Answer
Pourquoi procéder à une mutagénèse?Importance des résidus ou des segments de protéines pour tester la fonction et la localisation.
Pourquoi procéder à une mutagénèse? Exemples- Mutation d’une Tyr en Phe pour évaluer l’importance de la Tyr-P. - Mutation d’une Ser en Ala, d’une Thr en Ala et d’une Thr en Val pour évaluer l’importance de la Ser-P, de la Thr-P et de la présence de groupes OH. - Mutation d’une Cys en Ser pour évaluer l’importance de la formation potentielle de ponts disulfures. - Mutation des résidus Lys pour tester l’importance de l’ubiquitination et d’autres modifications post-translationnelles (mutation Lys en Arg). - Mutation des résidus hydrophobes d’une interface en résidus chargés positivement tels que Arg ou Lys pour tester l’importance de telles interactions. - Mutation des signaux de rétention dans le réticulum endoplasmique, tels que la séquence KDEL pour libérer les protéines du Réticulum Endoplasmique. - Mutation des principaux sites catalytiques des enzymes, par exemple les kinases créant des protéines kinase-dead.
Qu’est-ce qu’une mutagénèse dirigée?La mutagénèse dirigée se définit par l’introduction de changements à un niveau déterminé d’un nucléotide dans des cDNAs ou des gènes par l’utilisation d’approches de biologie moléculaire.
Le changement d’un nucléotide au niveau génétique peut menerà un changement d’identité de l’acide aminé qui peut s’avérer crucial pour la fonction d’une protéine (exemple: mutation Ras dans le codon 12, mutation V617F de JAK2, etc.)
Des substitutions, suppressions ou insertions de nucléotides peuvent menersoit à la formation immédiate de codons STOP, soit à des modifications de cadres donnant lieu à une séquence complètement différente.
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Section 3

Question Answer
La réaction de PCRPfuTurbo DNA Polymerase (1μl; 2,5 U/μl) / Water, Buffer, (DMSO) / dNTPs (10 mM) Template plasmids (< 10 μg)/ Primers (fwd & rv) (10 mM)
Transformation bactérienneProduit PCR digéré (1-5μl) (10 pg – 100 ng) / Bacteries (DH5α = E.coli Strain) = cellules chimiquement compétentes
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Étapes Transformation bactérienne 1) Incubation des bactéries + plasmides sur glace = 20 min 2) Transformation choc thermique, bain-marie à 42°C = 1 min 3) Incubation sur glace = 2 min 4) Ajouter 500 μl of LB (Lysogeny broth) 5) Prolifération à 37°C dans incubateur agitateur (180 rpm) = 1 heure 6) Etaler les bactéries sur une plaque de LB agar de 10 cm contenant l’antibiotique approprié (ex = ampicilline) 7) Incubation pour la nuit à 37°C
Préparation de plasmides à petite échelle 1) Prélèvement des colonies 2) Prolifération des bactéries dans 2 ml de LB + Ampicilline pendant la nuit, 37°C, dans incubateur agitateur à 180 rpm 3) Extraction et purification des plasmides (en utilisant un kit appelé Qiagen)/ Les minipreps sont vérifiées sur gel d’agarose 1% afin de vérifier leur taille

Section 4

Question Answer
Quelles sont les techniques d’analyse des mutagénèses?Alanine scanning et Glycine-Proline scanning.
Alanine scanning.Lorsque la fonction et la structure d’un segment de protéine ne sont pas connues, on peut changer un acide aminé ou un groupe d’acides aminés en Alanine. Ce résidu est électriquement neutre, il peut adopter plusieurs structures secondaires, il est bien toléré dans les hélices et ne modifie pas par lui-même la structure tridimensionnelle à moins que les résidus remplacés favorisent activement cette structure.
Glycine-Proline scanning.Lorsque l’on prédit que la structure d'une protéine contient soit des hélices α, soit des feuillets β, l'introduction de séquences GP (Gly-Pro) induira une flexibilité au niveau des ces structure secondaires et permettra de déterminer la nécessité réelle d'une de ces structure secondaires pour la fonction de la protéine. Les séquences GP déstabilisent les hélices α en solution, et les résidus Gly (G) permettent à eux seuls une apposition rapprochée des hélices transmembranaires (hélices α incorporées aux lipides).
Le « cysteine scanning »Introduction de résidus Cys à chaque position transmembranaire d'un récepteur afin de favoriser la dimérisation du récepteur (ancré dans la membrane) en présence du « cross-linker » (ici o-PDM)
Trois des mutants Cys ont générédes récepteurs à l’Epo constitutivement actifs de par la formation de dimères dans une orientation active
Comment utiliser une mutagénèse pour définir des domaines d’interactions?Troncatures progressives en ajoutant un codon STOP à différentes positions
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Section 5

Question Answer
Qu’est-ce que la mutagénèse aléatoire (random mutagenesis)?Approche de biologie moléculaire permettant d’introduire une variation aléatoire à chaque position de la séquence d'un segment de protéine. Une collection d’échantillons est générée où chaque construction présente un ensemble déterminé de mutations, habituellement 1 à 3 changements de nucléotides par construction. La collection est testée en tant que mélange (par des tests cellulaires) puis, en fonction des résultats, les séquences fonctionnelles sont identifiées à partir des cellules sélectionnées.
La mutagénèse « Cys scanning » et la mutagénèse aléatoire des domaines TM-JM de l’EpoR ont toutes deux mené àl’identification de trois nouveaux mutants constitutivement actifs dans lesquels les résidus 223, 226 ou 227 ont été mutés en Cystéine. De plus, la mutagénèse aléatoire a permis d’identifier d’autres mutations intéressantes au niveau du domaine transmembranaire conduisant à l’activation du récepteur.
Mutagénèse par saturationplacement de tous les acides aminés possibles à la même position
La mutagenèse par saturation au niveau du résidus W515 de TpoR explique pourquoiplusieurs mutations en acides aminés de charges et de polarités différentes sont détectées dans les néoplasies myéloïdes. Excepté W, C et P, tous les autres 17 acides aminés sont actifs à la position 515. Ainsi, la présence du tryptophane est obligatoire pour empêcher l'activation des récepteurs oncogènes
Mutagénèse vers des acides aminés non naturels (UAAs)Création de paires spécifiques d'ARNt et d'ARNt aminoacyle pour l'introduction d'UAA dans des protéines à des positions précises. Utilisation d'un codon STOP d'ambre (TAG) sur un site précis pour introduire le nouvel ARNt et l'ARNt d'aminoacyl synthétase.
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Section 6

Question Answer
Le système CRISPR/Casest à l’origine un système de défense adaptatif des bactéries/archées contre les bactériophages et plasmides invasifs
Lorsque qu’un bactériophage envahit une bactérieson ADN est clivé par des nucléases de la bactérie et des fragments de cet ADN sont ensuite incorporés dans le locus CRISPR du génome bactérien. Un fragment incorporé devient alors un ‘spacer
Les spacerssont séparés entre eux par des séquences répétitives courtes et palindromiques (les ‘repeats’).
Lors d’une ré-infectionpar un bactériophage, le locus CRISPR est alors transcrit en un seul ARN appelé le pré-CRISPR RNA (pre-crRNA).
Un trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA),ARN unique et non variable s’hybride alors avec chaque ‘repeat’ entre deux ‘spacer’.
Chaque couple spacer;tracrRNAs’associe ensuite avec une protéine Cas9 avant que la Rnase III ne clive le pre-crRNA au niveau du ‘repeat’. Ceci engendre alors un triplex appelé crRNA;tracrRNA;Cas9 (cadre noir)
Le mécanisme de la Cas9• Le crRNA est alors capable de s’hybrider avec un ADN spécifique avec lequel il s’apparie. La Cas9 exerce alors son action d’endonucléase pour cliver l’ADN reconnu mais cela ne peut se faire que si l’ADN ciblé contient le Protospacer Adaptor Motif (PAM) adéquat. • Le PAM de la Cas9 doit obligatoirement être ‘NGG’ (N pour n’importe quel nucléotide, G pour guanine). Ceci étant peu restrictif (il suffit de deux guanines qui se suivent pour former le PAM), la Cas9 peut couper virtuellement partout dans un génome donné. • Lorsque le crRNA s’apparie avec un ADN cible et que le PAM est présent dans la séquence, la Cas9 clive les deux brins d’ADN, réalisant un Double Strand Break (DSB).
L’utilisation de CRISPR/Cas9 pour modifier des génomes• En générant des séquences guides (crRNA) spécifiques et en les couplant à un tracrRNA et la Cas9, nous pouvons utiliser le système CRISPR/ Cas9 pour induire des DSB dans n’importe quel génome procaryote/eucaryote à un locus bien précis. • C ’ e s t e n r é a l i t é l e m é c a n i s m e d e réparation de l’ADN de la cellule qui permet d’introduire des modifications dans le génome (délétion, insertion, mutation).
• Non-homologous end joining (NHEJ)est un mécanisme simple ou la cellule tente de ‘recoller’ les deux bouts d’ADN ensemble. Ce système simple fait souvent des erreurs (insertions, délétions de paires de bases).
Homology Directed Repair (HDR)permet d’utiliser un brin d’ADN qui présente des séquences identiques avec le gène clivé pour le réinsérer en place de la cassure. Cette technique permet d’introduire des mutations précise dans un gène ciblé.
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Section 7