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Methodo ARN et proteine

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elodiepayet's version from 2018-03-05 16:34

Section 1

Question Answer
RT-PCR(RT-PCR) est une approche / technique couramment utilisée dans la biologie moléculaire pour détecter l'expression de l'ARN par la création de transcrits d'ADN complémentaires (ADNc) provenant de l'ARN. La RT-PCR est utilisée pour cloner les gènes exprimés par transcription inverse de l'ARN d'intérêt dans son complément ADN (ADNc). L'ADNc nouvellement synthétisé est amplifié à l'aide d'une PCR classique.La RT-PCR est utilisée pour le clonage d'ARNm, pour déterminer les résultats qualitatifs de l'expression des gènes ainsi qu’en combinaison avec la PCR quantitative dans les approches qRT-PCR, en tant que techniques de dosage des plus sensibles pour la détection des niveaux d'ARN
La q PCR (quantitative real-time PCR ) est devenue la méthode la plus précise et fiable pour mesurer l’expression d’un gène. o Les étapes de la réaction 1. Récolte des échantillons 2. Isolation de l’ARN 3. Transcription inverse= conversion ARN en cDNA 4. qPCR 5. Validation et analyse des résultats
La réaction de transcription inverseEnzyme transcriptase inverse / Amorces = primers = 100 ng/ul / dNTPs = 10 mM fournissent les nucléotides pour la synthèse d’ADNc / ARN = 1ng-1 ug/ Tampon (contenant Mg) / DTT = stabilise enzymes / Inhibiteur de RNAse 40U = évite la dégradation de l’ARN
La réaction de transcription inverse Etapes de la réactiono Dénaturation = 5’ 65° o Annealing = 10’ 25°c o Etape de transcription inverse = 50’ 50°c o Inactivation enzymes = 5’ 85°
Le template est le cDNA produit lors de la réaction de transcription inverse 2 grandes alternatives- Utilisation d’ agents intercalantsSYBR Green - Les réactions de 5’ nucléase = utilisation d’amorces (primers) et d’une sonde = ex Taqman
Agents intercalantsEx SYBR Green Se lie à l’ADN double brin Complexe DNA-agent intercalant émet de la fluorescence, proportionelle à la quantité d’amplicons. + = bon marché / - = moins spécifique, tout l’ADN double brin est détecté, y compris dimères de primers, gDNA contaminant
5’ Nuclease assay Ex TaqmanNécessite la présence de primers et d’une sonde d’hydrolyse. La sonde est marquée avec un rapporteur fluorescent (D) et un ou deux quenchers (Q). La présence d’un quencher en 3’ prévient l’extension de la sonde ADN par la polymérase ; quand la sonde est intacte, l’énergie émise par le rapporteur fluorescent est absorbée par le quencher. Durant l’étape d’annealing, les amorces (primers) et la sonde se lie à l’ADN. Celle-ci est intacte et la fluorescence émise est captée par le quencher. Durant l’extension, la polymerase commence la synthèse de l’ADN, s’étendant à partir de l’extrémité 3’ des primers. Quand la polymerase atteinte la sonde, son activité exonucléase la clive. La fluorescence n’est plus absorbée par le quencher et est détectée par la machine de q PCR. La polymerase continue ensuite l’extension des primers pour finir la synthèse de l’ADN double brin. /+ = • La présence de la sonde augmente la spécificité • Peut être utilisé pour du génotypage = ex JAK2V617F. On utilise dans une même réaction 2 types de sonde et des amorces qui reconnaissent soit l’allèle WT ou l’allèle muté. Les 2 sondes sont associés à des agents fluorescents différents (ex FAM ou VIC) ! on peut détecter dans un échantillon la présence ou pas de la mutation et son importance (« charge allélique). / - = Chère
Réaction proprement dite de qPCRSYBR GREEN ou Taqman (sondes) /Amorces = primers = 10 uM (spécifiques du gène évalué) / ADNc produit lors de la réaction de transcription inverse / Polymerase / Tampon
Les valeurs de Ct= cycle threshold = valeur à laquelle la courbe PCR croise le seuil.
Ct élevé (ex 30-35)gène faiblement exprimé (il faut plus de cycles PCR pour détecter l’amplification fluorescente).
Ct faible (ex 10-15)gène fortement exprimé
Comment les résultats sont exprimésGénéralement sous forme d’expression relative = on compare l’expression d’un gène entre 2 tissus, de conditions de traitement, etc.
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Section 2

Question Answer
Séquençage d’ARN monocellulaireIsolation d'une seule cellule, extraction et amplification d'acides nucléiques, préparation au séquençage de la collection d’ADN, séquençage et analyse de données bioinformatiques. Au niveau de la quantité d'acides nucléiques utilisés (de l’ordre du picogramme), une amplification importante est souvent nécessaire lors de la préparation des échantillons du séquençage d'une seule cellule Les échantillons hétérogènes, les types de cellules rares, les relations des lignées cellulaires, la mosaïque des tissus somatiques, les analyses de microbes qui ne peuvent pas être mis en culture et l'évolution de maladie peuvent tous être élucidés par le séquençage d’une seule cellule.
RNA SeqLe nombre de séquences (lectures, fragments) reflète l'abondance = expression génique différente " Toute position à laquelle la séquence diffère du génome de référence= variante (polymorphisme/mutation)
L'endoglycosidase Hclive la liaison dans le noyau diacétylchitobiose du ligosaccharide entre deux sous-unités N-acétylglucosamine (GlcNAc) directement proximales au résidu d'asparagine, générant une molécule de sucre tronqué avec un résidu Nacétylglucosamine restant sur l'asparagine
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Section 3

Question Answer
Spectrométrie de masse pour les protéines• Détermine la masse moléculaire des composés chimiques par séparation ionique moléculaire en phase gazeuse en fonction du "rapport masse / charge" (m / z) • Les ions sont générés par l’ajout ou la perte de charge (protonation, déprotonation ou injection d'électrons) • Les ions générés peuvent être séparés dans des sous-­‐fragments moléculaires qui renseignent sur la structure du composé à analyser
Marquage des protéinesajout d'une séquence exogène courte dans une région qui ne perturbe pas la structure des protéines. Cette séquence courte est immunogène et des anticorps ont été obtenus contre cette séquence
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