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Immunohistochimie

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elodiepayet's version from 2018-06-04 06:41

Section 1

Question Answer
Immunohistochimie ? Combinaison de l'immunologie et l'histologie
Quelle propriété immunohistochimie ?Propriété antigénique
La structure d'un Ac• 2 chaines lourdes et 2 chaines légères. / • Une partie constante CH (CH1, CH2, CH3) et une partie variable VL, VH / • Relié par des ponts dissulfures /
Différentes variations Variation isotypique / Allotypique / Idiotypique
Variation isotypiquedifférentes classes et sous classes de chaines lourdes et légères chez tous les individus d'une même espèce
Variation allotypique Variation génétique à l'intérieur d'une même espèce animale. Un allotype n'est pas retrouvé chez tous les membres d'une espèce
Variation idiotypiqueVariation dans le domaine variable - hypervariable. Spécifique d'un seul clone
Différents domaines d'un Ac F(ab)2, F(ab), Fc
Nature bi-fonctionnelle Domaine V et C
Domaine V se lie à l'Ag
Domaine C se lie à une cellule ou Ac
Ac polyclonaux• réponse immunitaire naturelle => Ac d'affinité et de spécifité différentes. / • Mélange hétérogène / • Plusieurs Ac contre un même Ag / • Un Ac peut se lier à plusieurs épitopes / • Anti séra unique et quantité limitée
Ac monoclonaux1) on isole les cellules de la rate d'une souris et on les fusionne avec un myélome / 2) On les identifie et on les clones / 3) Un ac produit un hybridome / Réaction d'un Ac avec un épitope d'un même ag
Comparaison ac polyclonaux et monoclonauxvoir tableau
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Section 2

Question Answer
AgSubstance capable d'induire une réaction immunitaire / est composé de nombreux épitopes (chaine continue d'AA, nucléotides, sucres...)
Organisation spatiale Liaison tridimensionnelle
Sites de liaison de l'Ag1) Site séquentiel / 2) Site conformationnel / 3) site poly fonctionnel
Approche physico chimique (type de liaison)Liaison hydrogène, liaison électrostatique, liaison de van der waals, liaison hydrophobes
Liaison H Ponts H entre groupements carbonyle-hydroxyle, amines, multiples
Liaison électrostatique Charges de signes opposées qui s'attirent
Liaison de Van der Waals • Adaptation stérique parfaite / • interactions entre différents nuages électroniques
Liaison hydrophobes association entre groupement hydrophobe et non polaires
La liaison Ag-Ac est-elle covalente ? Non, la réaction est réversible / Loi d'action des masses
Affinité force d'une liaison Ag-Ac, somme des forces attractives et répulsives
Avidité affinité multivalente
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Section 3

Question Answer
Immunodetection principe de base1) mise en évidence de l'accrochage des Ac (Flurochrome, enzyme) 2) "Explosion" des systèmes d'immunodétection = Fragment Fc reconnaissable par un autre Ac ("espèce spécifique")
Flurochrome but ?source lumineuse, chemin optique / méthode d'illumination & filtre
Avantage fluorochrome méthode rapide / très bonne résolution anatomique = subcellulaire / combinaison de couleurs
Réaction enzymatiqueDépart = un substrat soluble et peu/ou pas coloré / à la fin = produit dense et coloré
Équation de la réaction enzymatique ES => E + produit final (chromogène)
Produit final = précipité immunohistochimie
produit final = soluble ELISA
HRP éxogèneDAB + H2O2 => DAB* + 2H2O
DAB*= oxydé = précipité brun
DAB nom3,3'diazodenzidine
AEC nom3 amino 9 ethylcarbazole
AEC précipité brun-rouge (uniquement milieu aqueux)
CN nom4 chloro 1 naphtol
CN précipité bleu diffus (uniquement milieu aqueux)
Comment inactiver l'activité peroxydase endogène ? Méthanol/H2O desionisé + H2O2 => Epuisement
Alcaline phosphatase réaction en combien d'étape ? 2
Réaction alcaline phosphatase Naphtol phosphate est hydroxylé par la phosphatase en "phenol" / phénol + sels de diazonium (chromogène) => formation d'un précipité
Comment inactiver l'activité endogène de l'alcaline phosphatase endogène ? + Lévamisole => inhibition
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Section 4

Question Answer
Système direct Ac primaire marqué / Une incubation / suivie de la visualisation
Avantage du système directRapide
Sensibilité du système directfaible
Inconvénients du S.D Marquage Ac Iaire / inactivation possible
Système indirect 1er incubation = ac primaire / 2eme incubation = ac secondaire porteur d'un marqueur de visualisation
Spécificité du S.Ibonne
Avantage S.I Evite de marquer l'anticorps primaire / amplification du signal (vs système direct)
Inconvénients S.I plusieurs Ac
Système PAP 1ere incubation de l'Ac primaire / 2eme incubation de l'Ac secondaire "bridge" / 3eme incubation d'un complexe composé de 2 Ac (de même nature que l'Ac primaire) et de 3 molécules d'enzyme
Spécificité Système PAP Très bonne
Avantage Système PAP Amplification du signal (vs système indirect) / Technique standardisée
Inconvénients Système PAP • Flexibilité du système lors de l'adaptation à d'autres espèce / • double marquage très limité / • Risque de faux négatifs (effet bigbee)
Détection optimale Quantité d'Ac > quantité d'Ag
Effet bigbeeQuantité d'Ag > quantité d'Ac => Faux négatifs par blocage des sites antagoniques de l'Ac primaire lors de la première incubation / Ac bridge ne lie plus le PAP
Système streptavidine biotine les composantsbiotine + Streptavidine + marqueur
biotine vitamine de faible poids moléculaire (244 Da)
Streptavidine • 4 sites de liaison à très grande affinité pour la biotine / • P. Isoélectrique proche de la neutralité
Marqueur Enzymes; fluorochrome
Sensibilité Système streptavidine biotine excellente
Avantage Système streptavidine biotine Excellent rapport signal/bruit / Amplitude du signal (vs système indirect) / facilité d'emploi
Inconvénients Système streptavidine biotine biotine endogène (démasquage) / taille du complexe (à éviter quand les membranes sont intactes)
Sensibilité En vision +TM Très bonne
Avantage vision +TM La molécule de dextran contient 100 Ac + 25 enzymes / facilité d'emploi / Excellent rapport signal/bruit / • évite biotine endogène
Inconvénients vision +TMTaille du complexe / accrochage aux lectines
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Section 5

Question Answer
Fragments Fab/ Fab2 Taille des Ac, des complexes de révélation - pénétration tissulaire / • Choix posé en fonction de la méthode d'observation
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Section 6

Question Answer
Immunodetection multiple interet ? • Relations spatiales entr plusieurs antigènes / • contenus Ag différents
Immunodetection multiple techniques ? 1) coupes sériées / 2) Marquage des 2 cotés de la coupe / 3) Marquage d'un même coté de la coupe
Immunodetection multiple => détection multiple Simultanée et séquentielle
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Section 7

Question Answer
Dilution optimale Notation des marquages et évaluation de l'intensité
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Section 8

Question Answer
La spécificité de la détection immunohistochimique dépend 1) du changement de réactivité de l'épitope / 2) Spécificité de l'Ac primaire / 3) Système de révélation & d'amplification
Quelles sont les différents contrôle de la spécificité de l'Ac primaire 1) contrôle indirect / 2) Contrôle direct / 3) contrôle direct = absorption-compétition / 4) marquage non immun
1) du changement de réactivité de l'épitope• Fixation et enrobage (facteurs chimiques) / • Oxydation durant le stockage (méthionine, tyrosine, tryptophane) / • Solution dénaturante (pré-traitement, démasquage) / • Solution d'élution (immunodétections multiples)
Controle indirectNe dispose pas de l'antigène ex = tissus qui n'expriment pas d'Ag
Controle direct • Disponibilité du peptide pur en quantité / • Ac en présence du peptide immunogène (sur membrane, colonne, sur coupe..)
Controle direct ABSORPTION / COMPÉTITION principe ? Préincuber un Ac avec une concentration croissante Ag / Appliquer le mélange sur l'échantillon étudié
Controle direct ABSORPTION / COMPÉTITION résultat ? Diminution sensible de l'intensité du marquage en fonction des concentrations croissantes d'Ag ajouté (disparition complète du marquage n'est pas nécessaire)
Controle direct ABSORPTION / COMPÉTITION conclusion du test ? L'Ag ajouté et la substance révélée dans les tissus ont des épitopes identiques ou structurellement très voisins / Il est incorrect de conclure à leur identité (protéine)
Controle direct ABSORPTION / COMPÉTITION en pratique ? Compétiteur dilution variable ng/mL / Antisérum dilution constante
Marquage non immun (aspécifique)1) Augmenter le pH - Augmentation de la force ionique - Pré-traiter la coupe avec un cation / 2) Diminuer la force ionique - Ajoute un agent mouillant / 3) Augmenter la force ionique / 4) Pré-traiter avec un agent bloquant (albumine...) / 1,2,3,4- Pré-traiter avec sérum non immun de la même espèce que l'Ac secondaire
Système de révélation & d'amplification prendre en compte quoi ? • Origine manipulation du tissus / • source des Ac / • Présence de biotine et/ou d'enzymes endogènes
Système de révélation & d'amplification • Omission de l'Ac primaire / • Utilisation dans les mêmes conditions (classe Ig, source, concentration...) d'un Ac irrelevant / • Détection des sites spécifiques = groupements réactifs, "physical trap"
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