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Gene-Technologies d'analyse et genie genetique

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chemz's version from 2017-05-20 17:48

0-Manipulation d'ADN au laboratoire

Question Answer
A quoi sert-recherche
-biologie clinique
-biotechnologies, pharmacologie
Recherche-mieux comprendre corps humains, maladies
Biologie clinique-mieux diagnostiquer maladies
Biotechnologies, pharmacologie-fabriquer des nouveaux types de medicaments
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1-Détéction de l'ADN et mesure de sa concentration

Question Answer
Absorbance a 260 nm-facile, peu specifique
-mesure la concentration d'une solution d'ADN pur
Formation d'un complexe fluorescent-plus sensible, plus specifique
-agent fluorescent se fixe sur ADN (ex. agent intercalant)
-longueur d'onde emise > longueur d'onde absorbee
-mesures influencees par denaturation
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Agent intercalant de l'ADN fluorescent

Question Answer
Caracteristiques-molecule capabable de se glisser entre 2 paires de bases (fuorescence augmente quand insere sur ADN
-composes plans (aromatiques -> interactions avec bases dessus et dessous, cycliques)
-indusisent une distorsion de l'ADN -> perturbe replication des agents mutagenes
Application-detection fluorescence ADN bicatenaire
Exemples-bromure d'ethidium
-SYBR-green
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Agent intercalant de l'ADN anti-cancereux

Question Answer
Caracteristiques-agent intercalant qui interfere avec la replication de l'ADN
-bloque divison cellulaire en phase S
Application-traitement de certains cancers
-effets secondaires non-negligeables!
Exemples-doxorubicine
-famille des anthracyclines
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2-Separation d'un melange d'acides nucleiques

Question Answer
Destine a-ADN/ARN charges negativement
Separation-selon la taille par electrophorese
-migration vers pole +
Caracteristiques dans un gel-empeche les molecules de diffuser librement
-cree des mailles qui retiennent les molecules en fonction de leur taille
Application-gel d'agarose ou de polyacrylamide
-electrophorese capillaire
memorize

 

Question Answer
Definition agarose-polymere glucidique naturel
-soluble dans l'eau chaude
-forme un gel lorsque la solution est refroidie
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Cuve d'electrophorese chargee

Question Answer
Concept-separation des molecules d'ADN dans un gel d'agarose
Etapes-on introduit ADN dans puits
-migration de l'ADN de - vers + sur gel d'agarose
Solutions ioniques-permeteent a l'electricite de passer
Pourquoi ADN negatif?-a cause des phosphates
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Gel visualise en presence de bromure d'ethidium

Question Answer
Position des fragments-grands fragments avant petits car mailles du gel freinent les grands fragments
Sensibilite-ng (10^-9) d'un fragment d'ADN ou d'ARN
Fonction-separe les fragments de tailles differentes (inf eo egal a 10 000 nucleoties)
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Separation de molecules d'ADN par electrophorese capillaire

Question Answer
Gel-polyacrylamide
Dispositif-Melange d'ADN introduit dans le capillaire rempli de gel
Fonctionnement-migration de - vers + et arrive au detecteur
-petites molecules sortent en premier
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3-Hybridation des acides nucleiques

Question Answer
But-analyser la sequence d'ADN
Fonctionnement-appariement de 2 acides nucleiques (simple brin, ADN ou ARN) dont la sequence est complementaire
-on met une sonde pour detecter la radioactivite et voir si la sequence est complementaire
-sequence non complementaire eliminee par lavage
Facteurs qui influencent la reaction-complementarite
-temperature
-proportion de GC (+ il y a de GC, + c'est stable)
-pH
-composition ionique de la solution
Caracteristiques-grande specificite de la sequence
-quantitatif
-influence par facteurs
Applications qui permettent de detecter une sequence donnee-southern blot
-northern blot
-PCR
-microarray
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Tranfert Southern Blot

Voir synthese

4-Fabrication d'ADN artificiel

Question Answer
Techniques-methode chimique
-methode enzymatique
-methode biologique (E. Coli)
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Methode chimique

Question Answer
Caracteristiques-cycle de synthese a l'aide de nucleotides modifiees
-automatise
-permet de creer sequence monocatenaire (<200 nucleotides) "oligonucleotides"
-synthese dans sens non-naturel (3' -> 5')
-possibilite d'incorporer nucleotides modifies (avoir ADN anormal)
-double brin cree a partir de 2 sequences complementaires monocatenaires
-methode de choix pour sequences courtes
-assemblage possible de morceaux pour creer des sequences de plusieurs kb "genes synthetiques"
Etapes-protection des groupes sauf OH de base 1 et P de base 2
-base attachee a 1 support solide (petite bille dans un tube a essais) avec -O
-SN entre OH base 1 et P base 2
-ajout de reactif permettant oxydation du phosphore
-fin du cycle 1
-deprotection de R1 (lie a O)
-cycle 2
-fin
hydrolyse des groupes protecteurs du support et purification
Pourquoi deprotection des groupes?-sans deprotection on aurait eu polymerisation en chaine
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Methode enzymatique

Question Answer
On utilise-ADN polymerase bacterienne purifiee (recombinante, 1 seul polypeptide)
Conditions de travail-equivalentes a la replication
-dATP, dTTP, dCTP, dGTP
-amorce (+ ou - 20 nucleotides)
-recopie une matrice
-allonge a l'extremite 3'
-inflencee par presence d'ions, pH, temperature
Synthese d'une sequence qu'on veut?non car il faut fournir brin matrice
Applications-sequencage
-PCR
Etapes-separation des 2 brins d'ADN a haute temperature
-hybridation d'un oligonucleotide synthetique (+ ou - 20 nucleotides) a une temperature proche de Tm
-+ ADN polymerase, dATP, dTTP, dCTP, dGTP
memorize

5-Sequencage

6-Transcription inverse et PCR

7-Enzymes de restriction