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BIOMOL 2 - Techniques de séquençage, d'amplification & de purification

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baharicot's version from 2016-06-22 16:23

Théorie - quelques notions importantes

Question Answer
DEAE cellulose - résine chargée ... +
Focalisation isoélectrique - gel contient souvent...de l'urée (! dénaturant !)
Agents capables de dénaturer les protéines ? (11) chlorure de guanidium, 2-mercaptoethanol, SDS, KSCN, urée, DTT, acétone [CO(CH3)2], NaBr, LiCl, LiBr, CaCl2
Donner les différentes T° utilisées lors d'une PCR95° pour séparer l'ADN bicaténaire en ADN monocaténaire, 60° pour fixer les amorces, 72° pour l'ajout d'ADN poly et de dNTP
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Techniques d'amplification ou de fabrication de l'ADN

Méthode chimique

Question Answer
3 caractéristiques-clés- cycle de synthèse automatisé à base de nucléotides modifiés (pouvant être marqués par fluorescence ou radioactivité)
- création d'ADN ou d'ARN monocaténaire dans le sens non naturel 3'->5'
- Longueur max = 200 nt
Réactif libredésoxynucléotide modifié avec:
- un PO2 lié à un groupe sortant en C3'
- des groupes protecteurs: R1 sur l'oxygène en C5', R2 sur PO2, R3 sur base azotée
Réactif fixédésoxynucléoside fixé sur un support solide, avec un groupe protecteur R3 sur sa base azotée
Cycle 1 - explique1) OH en C5' du réactif fixé attaque PO2 du réactif libre -> expulsion de son groupe sortant.
2) Obtention d'un dimère dans le sens 3'->5'. Formation de PO3.
3) Oxydation du PO3 en PO4.
Cycle 2 - explique1) Déprotection du O-R1 (situé en 5') du réactif libre -> devient OH.
2) Réactif libre attaque un nucléotide, selon le modèle du cycle 1.
Rôle des groupes protecteurs- R1 (Oxygène en C5') empêche la polymérisation du nucléotide (limite l'ajout de nt)
- R2 (PO2) et R3 (base azotée) empêchent les réactions secondaires.
A la fin de tous les cycles - expliquehydrolyse des groupements protecteurs et du carbone 3' du réactif fixé au support solide.
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Méthode biologique

Question Answer
4 caractéristiques-clés- fabrication d'ADN au labo à partir de plasmides
- séquence d'intérêt à amplifier fusionnée à une séquence vecteur, permettant la réplication du plasmide dans E.Coli
- multiplication du plasmide dans la bactérie
- récupération, séparation de l'ADN génomique et purification
Etape 1amplifier le gène codant pour la protéine à partir de l'ADNc grâce à une PCR.
Etape 2- digestion de l'ADNc par des enzymes de restriction appropriées (2 points de coupure)
- digestion du plasmide par la même enzyme de restriction (un seul point de coupure car c'est circulaire).
Etape 3insertion de l'ADNc dans le plasmide.
Le vecteur plasmidique d'expression dans une bactérie comprend (6)
- promoteur bactérien
- séquence promotrice Shine-Dalgarno
- site de terminaison de la transcription
- ADNc avec un cadre ouvert de lecture, dénué d'introns
- départ de traduction ATG
- fin de traduction STOP
Le vecteur plasmidique d'expression dans une cellule eucaryote comprend
- promoteur eucaryote
- ADNc avec un cadre ouvert de lecture, dénué d'introns
- départ de traduction Kozak (ATG compris dedans)
- fin de traduction STOP
- site de polyadénylation pour queue poly-A
Etape 4 si on veut exprimer dans une cell. eucaryoteintroduction du plasmide construit dans E. Coli -> production en masse du plasmide mais pas de protéine (car les séq. de transcr/trad sont eucaryotes).
Etape 4 si on veut exprimer dans E.Coli
- introduction du plasmide construit dans E.coli
-> induction avec IPTG
-> départ de la transcription, puis traduction
-> production en masse du plasmide et la protéine
Etape 5 si on veut exprimer dans une cell. eucaryoteRécupération du plasmide et purification.
Etape 6 si on veut exprimer dans une cell. eucaryoteTransfection
-> production de la protéine dans la cellule eucaryote
-> extraction et purification de la protéine
Transfection - définitionintroduction du plasmide dans des cellules eucaryotes
Etape 5 si on veut exprimer dans E.Coliextraction et purification de la protéine
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Méthode enzymatique

Question Answer
4 caractéristiques-clés- Cycle de synthèse in vivo et pas de novo
- On utilise une ADN polymérase bactérienne recombinante, avec sens de synthèse naturel 5'->3'.
- Besoin d'une amorce, d'un brin matrice, de substrats = dNTP
- Dépend de la méthode chimique: amorce (oligonucléotide) synthétique
Etape 1ADN double brin séparé en 2 brins d'ADN monocaténaire grâce à la chaleur (haute T°).
Etape 2- Un oligonucléotide synthétique est hybridée sur un des brins au niveau de l'extrémité 3', à une Tm appropriée.
- ADN polymérase bactérienne synthétise le brin dans le sens naturel.
Séquençage de Sanger - butsynthèse artificielle de segments d'ADN à séquencer.
Séquençage de Sanger - étape 1dénaturation d'ADN bicaténaire en 2 brins monocaténaires.
Séquençage de Sanger - caractéristiques-clés- dépend de la méthode chimique: amorce d'ADN synthétique
- nécessité d'avoir le début de l'ADN à séquencer pour fixer l'amorce
- ADN polymérase et synthèse dans le sens naturel
- besoin de dNTP & de ddATP
Séquençage de Sanger - la version moderne comprend...- pas seulement ddATP mais aussi ddTTP, ddGTP, ddCTP
- les ddNTP sont tous marqués par fluorescence avec une couleur spécifique
- étalonnage selon la couleur càd le type de ddNTP utilisé -> séquençage complet
Séquençage de Sanger - étape 2- fixation de l'amorce d'ADN sur l'extrémité 3' d'un des brins (n'importe lequel)
- hybridation de l'ADN poly à l'amorce et allongement de l'extrémité 3' de cette dernière
Séquençage de Sanger - étape 3si le substrat est le ddATP, l'absence de OH en C3', remplacé par H, empêchera la formation d'un lien phosphodiester covalent avec les autres nt -> séquence interrompue.
Séquençage de Sanger - étape 4- transfert des fragments d'ADN obtenus sur gel d'électrophorèse capillaire
- étalonnage selon le nombre de fragments obtenus et leur taille
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