Create
Learn
Share

1 methode purification des proteines

rename
elodiepayet's version from 2018-03-07 15:45

Section 1

Question Answer
Qu’entend-on par purification ? -une cellule contient plusieurs milliers de protéines différentes -l’abondance d’une protéine donnée souvent < 1/1000 -on veut séparer une protéine donnée de toutes les autres protéines
Pourquoi purifier une protéine ?-Purifier la protéine pour l’étudier (recherche).
-Purifier la protéine pour l’étudier (recherche). Quelques exemplesa-Etudes structurales
a-Etudes structuralesconnaître la structure d’une protéine permet par exemple de mieux comprendre son mécanisme catalytique ou de développer des inhibiteurs spécifiques
Principe de la cristallisationles molécules de protéine se séparent de la solution et forment des agrégats non cristallin les molécules de protéine s’agrègent et forment des cristaux la protéine est en sursaturation, mais aucun cristaux ou agrégat ne se forme
1.2 Pourquoi purifier une protéine ?-Purifier la protéine pour l’étudier (recherche) -Purifier la protéine pour l’utiliser (production)
-Purifier la protéine pour l’étudier (recherche)Etudes de structure (cristallographie, spectre infrarouge, CD) Préparation d’anticorps Etude d’interactions avec ligands Séquençage (par spectro de masse) Etudier la spécificité d’une enzyme
-Purifier la protéine pour l’utiliser (production)Usage thérapeutique = tPA, insuline / Usage alimentaire (alimentation humaine ou animale) = pectinases (pour produire du jus de pomme trouble) Utiliser l’enzyme comme outil (dosage) Usage industriel = produits de nettoyage protéases (taches de sang, sueur, …) lipases (sauces, maquillage, …) amylase (pates, chocolat, …)
memorize

Section 2

Question Answer
-purification partielle-étudier la spécificité d’une enzyme -alimentation animale
-purification à homogénéité-structure -anticorps -alimentation humaine ou usage thérapeutique
1.4 Développer une stratégiedévelopper une stratégie en tirant parti du fait que les protéines diffèrent entre elles par = - leur solubilité - leur stabilité thermique - leur taille - leur charge (calcul du pI) - leur hydrophobicité - leur affinité pour des ligands
2. Les problèmes auxquels il faut faire face1-Dénaturation 2-Protéolyse 3-Perte d’un ou de plusieurs constituants indispensable(s) à la fonction
1-Dénaturationperte de structure tertiaire
perte de structure tertiaire remèdes-travailler à basse température -congeler les échantillons à très basse température = -75°C -tampon adéquat -stabilisateur: sel, …
2-Protéolysedigestion par des protéases
digestion par des protéases remèdes-travailler à basse température -inhibiteurs de protéases Leupeptine = inhibe protéases sériques (trypsine, …) et quelques protéases à cystéine PMSF= inhibe protéases sériques et quelques protéases à cystéine EDTA= inhibe métaloprotéases
3-Perte d’un ou de plusieurs constituants indispensable(s) à la fonction-cofacteur -autre protéine
Dosage spécifique de la protéine à purifierPropriétés - Spécifique - Sensible - Précis - Pratique Exemple - mesure de l’activité enzymatique Importance de définir une Unité (quantification)
2. Dosage de protéinesA-Méthodes basées sur l’utilisation de Cuivre: Lowry et BCA
memorize

le système pET

Question Answer
Promoteur T7 RNA pol-promoteur fort -bon contrôle -plus de 40 vecteurs pET
Avantages-promoteur de T7 est fort -peu reconnu par la RNA polymérase de coli -une forte régulation = deux niveaux (protéines toxiques ou difficiles à produire)
-Autres avantages de la surexpressionpermet de produire des protéines taggées permet de produire des protéines “fusionnées” His-tag, Streptag, … Fusion à la thiorédoxine, GST, …
memorize

Techniques d’extraction

Question Answer
But- libérer la protéine des cellules dans lesquelles elle se trouve - la mettre dans un milieu aqueux
Il faut donc - rompre les membranes (techniques d’homogénéisation) - en présence d’un milieu adéquat
Composition du milieu d’homogénéisation- Un tampon (à pH ≈ neutre si protéine cytosolique) - Un agent réducteur (si protéine cytosolique) - 0.5-1 mM dithiothréitol; 1 mM mercaptoéthanol - Sels (pour éviter certaine adsorption) - Inhibiteurs de protéases - 0.5 mM phenylméthylsulfonylfluorure (peu stable = utiliser AEBSF) - 1-5 μg/ml leupeptine et/ou antipaïne - EDTA (1 mM) - Stabilisateurs éventuels (en fonction de la stabilité de la protéine)
Techniques d’homogénéisation1. Presse de French ou 2. Cycle de congélation/décongélation ou 3. Sonication ou 4. Autres techniques
1. Presse de FrenchCompression importante (≈ 100 Atmosphères) dans presse hydraulique suivie d’un relâchement brutal - Permet de rompre la paroi de bactéries, de levures - Nécessite souvent plusieurs passages
2. Congélation/décongélationPhénomènes de - rupture par formation de cristaux -gonflement des cellules (congélation) puis contraction (décongélation) Réaliser 1-3 cycles de congélation/décongélation (décongélation en surveillant T°)
2. Congélation/décongélation applicationcellules eucaryotes / certaines bactéries (ajout de lysozyme)
Congélation/décongélation problèmescertaines protéines n’aiment pas cela !
3. SonicationOndes sonores à haute fréquence, provoquant des variations locales importantes de la pression Utilisée pour lyser des cellules eucaryotes et des bacteries. Les ondes sonores sont délivrées au moyen d’une sonde immergée dans la suspension cellulaire. L’énergie mécanique de la sonde provoque la formation de bulles de vapeur microscopiques dont l’explosion permet la propagation de l’onde dans l’échantillon. ! Attention = Provoque un chauffage important (refroidir correctement) Certains enzymes sont particulièrement sensibles.
Autres techniques-détergents -lyse osmotique -broyage, mixer
Centrifugation roleIndispensable pour éliminer le matériel insoluble et passer aux étapes suivantes
Extraction d’une protéine membranairePréparer un extrait à partir d’un tissu ou d’une culture Centrifuger à haute vitesse Resuspendre les protéines membranaires en homogénéisant dans un tampon contenant un détergent Il faut souvent essayer plusieurs détergents différents
Problème du SDStendance à dénaturer les protéines
Pour solubiliser les protéines membranaires, il faut utiliser des détergents qui préservent la structure de la protéine exTriton, Digitonin, CHAPS
memorize

Technique de purification

Question Answer
Technique de purificationextraction -> dégrossir -> purification partielle = étape de capture -> "polissage"
Dénaturation thermiquePerte de structure native quand on augmente la température. La dénaturation thermique est en général irréversible.
Réalisation d’une étape de dénaturation thermique à 60°C1) Incuber sous agitation dans l’incubateur 70°C jusqu’à atteindre 60°C 2) Tranférer dans l’incubateur 60°C et maintenir pendant 5 min 3) Refroidir dans la glace pilée 4
memorize

Techniques de précipitation

Question Answer
Techniques de précipitationSulfate ammonique = phénomène de « salting out » -Polyéthylèneglycol
Précipitation au sulfate ammonique-solubilité d’une protéine augmente à faible concentration en sel = “salting in” -solubilité diminue à forte concentration en sel -la nature du sel est importante: la série de Hofmeister pour les anions = SCN-<ClO4-<NO3-<Br-<Cl-<CHCOO-<SO4-<PO4- En ce qui concerne les cations: NH4+ > K+ > Na+ -rentre en compétition avec les protéines pour l’eau desolvatation = “salting out” -concentrations de 1 à 3,2 M (exprimées en %) -dépend surtout de l’hydrophobicité de la protéine -ajouté sous forme d’une solution saturée ou de cristaux -> augmentation de volume ! -il faut contrôler le pHmise à pH avec de l’ammoniaque -forte concentration en sel = pas de chromatographie sur échangeur d’ions ou d’affinité -RINCER
Polyéthylèneglycolpolymère d’éthylène glycol de masse variable -en général = -en solution PEG adopte une structure hélicoïdale -phénomène d’exclusion stérique = augmentation de la concentration locale en protéine -> précipitation
-précipitation dépend -du pH -de la concentration en sel (> 50 mM) -de la concentration en protéines -en général = concentration en PEG entre 6 et 20 % rendement excellent / facteur de purification faible pas avant gel-filtration
memorize
Chromatographie sur colonne chromatographie comment ? Il s’agit d’une chromatographie liquide
Question Answer
Chromatographie sur colonne définitionLa chromatographie permet la séparation des constituants d'un mélange. Elle est basée sur le partage de substance entre une phase mobile dans laquelle le soluté peut se dissoudre et une phase fixe sur laquelle le soluté peut se fixer.
Chromatographie sur colonne séparation des protéines en fonction de leur-charge -taille -hydrophobicité -affinité pour un ligand
Types de chromatographie Charge électriqueEchange d ’ions
Types de chromatographie HydrophobicitéInteractions hydrophobes
Types de chromatographie Affinité sélective pour un ligandChromatographie d’affinité
Types de chromatographie masse moléculaire de la protéine à l’état natifFiltration sur gel = chromatographie d’exclusion moléculaire
Chromatographie sur échangeurs d’anionsune protéine a - une charge positive aux pH < pI - une charge négative aux pH > pI
Les charges des protéines proviennent des -N et C termini -Asp, Glu, -Lys, Arg, -Cys, Tyr, -His -groupements prosthétique -modification covalente
Echangeur d’anionsgel porteur de charges fixes positives
Echageur de cationsgel porteur de charges fixes négatives
Les étapes de la chromatographie"équilibration, sample application, elution 1 2..., wash
memorize

Types de matrices utilisés dans les échangeurs d’ions

Question Answer
La matrice doit-être stable = volume constant -être résistante chimiquement -établir peu d’interaction non-spécifiques -être poreuse pour augmenter la capacité ou non-poreuse pour favoriser la résolution
En généralagarose ponté ou des polymères
Les types de matrice-matrice insoluble sur laquelle des groupements chargés ont été fixés de façon covalente -contre-ions mobiles
Chromatographie sur échangeurs d’ionsDEAE et Q
RésolutionDistance entre les maximums de deux pics comparée à la moyenne de la largeur de la base de ces deux pics
La matrice influence la résolutionPlus particules sont petites, plus la résolution est meilleure (mais pression !) Importance de bien “packer” la colonne
memorize